SEP SNEST DGEST
INSTITUTO
TECNOLOGICO DE CIUDAD ALTAMIRANO
MATERIA:
BIOTECNOLOGIA APLICADA
PRACTICA
No.4
SUBCULTIVO.
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
PROFESOR:
MC. FRANCISCO JAVIER PUCHE ACOSTA
LIC EN
BIOLOGIA VIII SEMESTRE
PRESENTAN:
Ma.
Yesenia Balandrano Alonso (08930258)
Diana
Vely García Banderas (08930286)
Anel Mojica Macedo (08930287)
Mayra
Alejandra Nambo Pérez (08930349)
Berenice Rubí
Pérez Sánchez (08930354)
Cd. Altamirano, Gro. México.
23 de marzo del 2012.
SUBCULTIVO.
(SIEMBRA DE MATERIAL YA ESTABLECIDO IN - VITRO)
La presente práctica se realizó en el
laboratorio de microbiología del Instituto Tecnológico de Cd. Altamirano, Gro.
Cuyo objetivo fue conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de
flujo, así como la asimilación de habilidades en la siembra. Para lo cual se
utilizó papel higiénico, pinzas, bisturíes, cajas de Petri estériles,
tapabocas, mechero, alcohol al 70% y 100% y agua destilada. Se preparó la
cámara de flujo laminar desinfectando con alcohol en su interior,
posteriormente el material vegetal y los medios preparados se transfirieron en
la cámara, después se esterilizó el
material vegetal con alcohol y agua y posteriormente se sacó en una caja de
Petri donde se dividió en partes pequeñas, posteriormente se sembró el material
vegetal en cada uno de los frascos de medios de cultivo sellándolos
completamente cada uno, una vez que se sellaron fueron guardados en un anaquel
para su optimo crecimiento.
Palabras
clave: material vegetal, cámara de flujo laminar, medios de cultivo,
siembra.
SUBCULTURE (PLANTING MATERIALANDESTABLISHEDIN -VITRO)
SUMMARY
This practice was
conducted in the microbiology laboratory of the Technological Institute of
Ciudad Altamirano, Guerrero. Aims to better understand the proper handling of plant
material flow chamber and the assimilation of skills in planting. Which was
used for toilet paper, forceps, scalpels, sterile Petri dishes, masks, cigarette,
alcohol 70% and 100% and distilled water. Was prepared in the laminar flow
chamber disinfected with alcohol in its interior, and subsequently the plant
material prepared media were transferred into the chamber, after the plant
material was sterilized with alcohol and water and then pulled in a Petri dish which
was divided into small parts, then the plant material was planted in each culture
media bottles completely sealing them each once sealed were kept on a shelf for
optimal growth.
ÍNDICE
Pág.
I. Antecedentes……………………….……………………………………...….…5
II. Definición del
problema……………………..……………..…………..…….…7
III. Objetivos…………………………..………………………………………….….8
IV.Justificación………………………………………………………….………......9
V. Fundamento teórico………………………...………….……………..……..…10
VI. Materiales y Métodos……………………………………………………....….15
VII. Resultados y
discusión…..………..…………………………………….......22
VIII. Conclusiones y Recomendaciones…….……………………………....….25
IX. Fuentes consultadas…………………,………………..……………….....…26
X. Anexos………………………………...…………………………………….....27
I.ANTECEDENTES
El cultivo de tejidos vegetales o cultivo in vitro de tejidos
vegetales, es una técnica de reproducción en condiciones totalmente asépticas,
en la que a partir de un pequeño segmento inicial de tejido es posible
regenerar en poco tiempo miles o millones de plantas genéticamente iguales a la
planta madre, cuando a este tejido le es aplicado un estímulo por medio de
variables físicas y químicas controladas en un medio de cultivo. A diferencia de las técnicas tradicionales de
cultivo, esta poderosa herramienta permite la propagación de grandes volúmenes
de plantas en menor tiempo; así como el manejo de las mismas en espacios
reducidos. Por otro lado, la técnica es de gran utilidad en la obtención de
plantas libres de patógenos; plantas homocigotas, en la producción de plantas
en peligro de extinción, en estudios de ingeniería genética, etc. El enorme
potencial que posee esta metodología ha propiciado que en los últimos 25 años
se haya incrementado el número de laboratorios de cultivo de tejidos en el país
para la producción comercial de plantas ornamentales y frutales al lo que ha
motivado que algunos floricultores la estén utilizando como una alternativa
viable en sus programas de producción (Kite, L., 1983)
La década de
los 70 puede considerarse la “década prodigiosa” del cultivo in vitro en
España. De esta época saldrán los líderes que serán los responsables de los
grupos más consolidados del cultivo in vitro. Líderes que, de alguna forma y
porque la historia así lo quiso, completan su formación en las dos escuelas del
cultivo in vitro de entonces. De una parte, destaca el Dr. White en USA que, en
1934 publica el cultivo indefinido de la raíz de tomate; por otra, merece
mención especial Gautheret, en Francia que, en 1939 publica por vez primera el
cultivo indefinido de callos de zanahoria. Las dos “escuelas” utilizan el
cultivo in vitro como herramienta de trabajo pero mientras los americanos
tratan de utilizarla como una metodología para resolver problemas reales que
les preocupan, la “escuela” europea trata de utilizar el cultivo in vitro como
una herramienta que le permita conocer aspectos fundamentales de la
histodiferenciación celular. En aquella época las diferencias eran tan notables
que mientras los europeos cerraban sus tubos de cultivo con algodón y “papel de
estaño” (que era como se le llamaba entonces al actual albal) los americanos
lucían en sus gradillas el colorido multicolor de los famosos Kap-uts de Bellco
(Antonio Ballester, 1999).
En octubre de 1994, se
inició la operación de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales in
vitro, en el Colegio Profesional de Biólogos del Estado de Veracruz A.C.
con la finalidad de desarrollar técnicas para la propagación de especies
vegetales de interés ecológico y económico. En enero de 1995, se iniciaron las labores
de siembra de tejidos en especies ornamentales de interés económico en la
región. A la par de estas actividades, se ha hecho promoción del proyecto en
los medios de comunicación locales con el fin de dar a conocer al público las
ventajas de utilizar la técnica mencionada para la propagación de plantas
ornamentarles difíciles de obtener por los métodos tradicionales., (Davies R.D.
et al, 1980)
La totipotencialidad celular fue enunciada como teoría
por Gottlieb Haberlandt en 1902, quien propuso que todas las células vegetales
tienen la capacidad de regenerar plantas completas. Haberlandt no llegó a demostrar su hipótesis
debido a que no pudo lograr la división celular ya que los medios de cultivo
que empleaba no incluían reguladores del crecimiento debido a que esos
compuestos eran desconocidos en ese momento. Recién en 1934, Philip White pudo mantener, en forma
ilimitada, el crecimiento de raíces en medios líquidos a partir de ápices del
tallo de tomate. Al mismo tiempo se identificó
el ácido indol
acético (AIA), que posibilitó el mantenimiento indefinido de callos
de zanahoria y tabaco in vitro.
Posteriormente se descubrió el efecto de la leche
de coco como estimulante de la formación de callo sobre el
cultivo de embriones de Datura stramonium. En 1948 Folke Skoog y Cheng Tsui, trabajando con cultivos
de callo de tabaco, demostraron la existencia de una regulación química en la
parte aérea y en la raíz. Trabajos posteriores en callos de la misma especie,
con el agregado de cinética, la primera citocinina descubierta, permitieron
demostrar que la diferenciación de brotes, raíces o de ambos, estaba regulada
por el balance de auxinas y citocininas
(Mroginski, Sansberro y
Flaschland, 2010).
II. DEFINICION DEL PROBLEMA
En esta
presente practica se realizó la siembra
de los explantes de yuca de manera adecuada para que no se contaminen
con bacterias y hongos y se puedan desarrollar las plántulas de manera libre y
logre crecer para extraerlo y cultivarlo nuevamente a un medio de cultivo in
vitro. Cabe mencionar que se requiere mucho cuidado al realizar la siembra de
los explantes ya que si no se realiza una buena siembra el cultivo se
contaminara esto debido a que es posible que el explante traiga una cepa de
hongo o bacteria o que el cloro utilizado no fue muy eficiente.
III. OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
v Conocer
la forma de establecer un medio de cultivo
y la forma de sembrar los explantes en el medio de cultivo.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
v Conocer el manejo apropiado del material vegetal en cámara de flujo Yuca: Manihot
esculenta).
v Asimilación de habilidades en la siembra.
IV. JUSTIFICACION
Esta
práctica se realizó con la finalidad de saber cómo sembrar un explante ya que
debido a esto se realizara en un medio de cultivo en el cual será sembrado un
explante de yuca (Manihot
esculenta) con la finalidad de que logre crecer libre
de enfermedades. La siembra se realizó en la campana laminar la cual se preparó
y fue desinfectada con alcohol al 70° para estar libre de contaminantes y se
desarrollen los expalntes.
V.
FUNDAMENTO TEORICO
5.1 CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES
El cultivo de tejidos vegetales
se define como un conjunto muy heterogéneo de técnicas que presentan en común
el hecho de que un explante o sea, una parte separada del vegetal, tales como protoplastos, células, tejidos u órganos se cultiva asépticamente en un medio artificial de composición química definida y se incuba en condiciones ambientales
controladas. Estas técnicas pueden ser utilizadas en vegetales como
herramientas para micropropagación, propagación rápida de clones, eliminación de virus y enfermedades, producción de haploides, aislamiento y utilización de protoplastos, cultivo de embriones,
producción de fitoquímicos, ingeniería
genética, mutación y selección celular, producción de semillas
sintéticas y estudios
básicos de anatomía, desarrollo, fisiología y nutrición vegetal. (Flaschland,
2010).
El cultivo de tejidos se inicia con la disección microscópica de la
planta bajo condiciones estrictamente higiénicas con el propósito de transferir
un tejido que crece activamente (los tejidos meristemáticos) con seguridad y
limpieza dentro de un recipiente estéril sin introducir microorganismos contaminantes. Las células y tejidos que crecerán y se desarrollarán a
partir del explante original depende de los objetivos del cultivo de tejidos.
En algunos casos las células conformarán una masa aparentemente desorganizada,
conocida como callo, en otros estarán presentes otras estructuras reconocibles como tallos, raíces, bulbos u otros órganos. Estos tejidos cultivados in vitro se hallan
dentro de un microcosmos estéril de un recipiente de vidrio o de plástico,
protegidos del medio exterior no estéril. Es esencial mantener la esterilidad
del medio ambiente confinado en el recipiente, debido a que cualquier
microorganismo que se gane la entrada al mismo crecerá oportunísticamente a una
velocidad mucho más rápida que los tejidos vegetales y eventualmente
colonizarán y matarán a los tejidos. Con el propósito de sostener el vigor de
los tejidos vegetales y permitir que ellos crezcan, se multipliquen y
desarrollen, esto es «cultivar los tejidos», deben proveerse además ciertos
requerimientos externos. Los tejidos pueden necesitar que se los apoye o sean
colocados sobre o en el interior de la superficie de un gel acuoso solidificado
con agar o pueden colocarse en un medio líquido. Los tejidos también necesitarán
de un suministro de los elementos minerales nutritivos que son esenciales para
el crecimiento vegetal, también posiblemente algunas vitaminas, azúcares como fuente de energía y una mezcla de hormonas
vegetales que se conoce que controlan
el crecimiento y desarrollo de estos tejidos particulares. Para el correcto
crecimiento y desarrollo del tejido en cultivo en general es necesario el suministro
de luz a intensidades muy bajas, mucho menores que la de la luz solar. La
acumulación en las plantas de la energía de los carbohidratos provendrá de los
azúcares agregados al medio de cultivo, más que de la fotosíntesis, de manera que son innecesarios altos niveles de luz. (Neumann, K.H.
1997).
5.2 BASE BIOLÓGICA
La reproducción
asexual de plantas por cultivo de
tejidos es posible gracias a que, en general, las células de una planta poseen
la capacidad necesaria para permitir el crecimiento y el desarrollo de un nuevo
individuo, sin que medie ningún tipo de fusión de células sexuales o gametos.
Esta capacidad se denomina totipotencialidad
celular y es característica de un
grupo de células vegetales conocidas como células meristemáticas, presentes en distintos órganos de la planta. La potencialidad de una
célula diferenciada (una célula de conducción, epidérmica) para generar tejidos
nuevos y eventualmente un organismo completo, disminuye con el grado de
diferenciación alcanzado por esa célula, pero puede revertirse parcial o
completamente según las condiciones de cultivo a las que se la someta. El éxito
en la propagación de una planta depende de que se logre la expresión de la potencialidad
celular, es decir, de que algunas células recuperen su condición meristemática.
Para ello debe inducirse primero la desdiferenciación y luego la
rediferenciación celular. En condiciones naturales, un proceso de este carácter
sucede durante la formación de las raíces adventicias en el enraizamiento de
estacas, la formación de yemas adventicias o cuando se busca la propagación de
cualquier planta. Entre los factores más importantes para lograr la respuesta
morfogenética deseada se encuentra la composición del medio de cultivo. En todo
intento de propagación vegetal, ya sea in vitro o in vivo, el
carácter del proceso de diferenciación está regulado por el balance hormonal
propio y por el estado fisiológico del órgano, tejido o célula puesta en cultivo.
Sin embargo, ese balance puede ser modificado por el agregado de compuestos que
imiten la acción de las hormonas vegetales. Esos compuestos, denominados reguladores del crecimiento, son los que se emplean en los medios de cultivo para conseguir la
micropropagación de una planta. (Haberlandt, G. 1902).
5.3 ETAPAS DEL PROCESO
El cultivo de tejidos
vegetales es el proceso que se inicia con un explante y termina con la
obtención de plantas completas, lo que involucra una serie de etapas, las
cuales se enumeran a continuación:
- Elección de la planta y/o tejido donante de explantes. En esta fase se incluyen los tratamientos, preparación y selección de las plantas madre a partir de las cuales se inicia el cultivo, siendo imprescindible comprobar la identidad (especie, variedad o cultivar) y su estado de salubridad (libre de patógenos, deficiencias o estrés).
- Establecimiento: consiste en la desinfección de los explantes (generalmente con hipoclorito de sodio) y su posterior adaptación al medio artificial de modo de inducir callo, brote, raíz o embrión somático, según se desee. Se requiere desinfectar superficialmente el material escogido para evitar que en el medio de cultivo crezcan microorganismos, principalmente bacterias y hongos, que competirán ventajosamente con el explante.
- Multiplicación: consiste en generar una cantidad de masa vegetal suficiente para la regeneración del número de plantas necesarias.
- Enraizamiento: es el proceso de inducción de la formación de raíces con el fin de convertir a los brotes o embriones somáticos en plántulas completas. El enraizamiento puede realizarse tanto en condiciones in vitro como ex vitro. En el primer caso se transfieren los brotes obtenidos en la etapa anterior a un medio libre de reguladores de crecimiento o que sólo contenga auxinas. Esta operación se realiza en condiciones de esterilidad (en cabina de flujo). En el segundo caso los brotes se sumergen en una solución concentrada de auxinas y se transfieren a un sustrato limpio, no necesariamente estéril, que puede ser una mezcla de turba con perlita o vermiculita. Los brotes que se utilicen en el enraizamiento ex vitro deben ser vigorosos y poseer hojas bien desarrolladas, ya que las plantas deben realizar la fotosíntesis para obtener la energía necesaria para desarrollarse y formar las raíces.
- Rusticación: es el paso de aclimatación de las plántulas obtenidas in vitro a las condiciones del ambiente usuales fuera del tubo o frasco, es decir al suelo o algún sustrato inerte.
El enraizamiento ex vitro
permite que la fase de enraizamiento y la fase de aclimatación se logren
simultáneamente y que raramente se forme callo en la base de los explantes,
asegurando así una conexión vascular, continua entre el vástago y la raíz. (Hicks G.S. 1980).
5.4 TIPOS DE MORFOGÉNESIS
En condiciones de cultivo in vitro, las células
somáticas pueden regenerar embriones o bien, brotes, raíces y/o flores. La
embriogénesis somática y la organogénesis son dos procesos morfogénicos muy
frecuentes en el cultivo in vitro de especies vegetales. La embriogénesis
somática es el proceso por el cual se obtiene una estructura similar a un
embrión cigótico sin que medie la fertilización de las gametas, mientras que
por organogénesis pueden obtenerse tallos, raíces o flores. Estos órganos se
obtienen a partir de una célula o de un grupo de células a través de un
complejo proceso denominado regeneración. La regeneración comprende diferentes
fases que se suceden de manera similar tanto para la organogénesis como para la
embriogénesis somática. Estas fases se denominan adquisición de la competencia;
fase de inducción y fase de realización. En la primera fase, las células no
responden al estímulo organogénico pero adquieren esa competencia durante una
fase de desdiferenciación. En la segunda fase o fase de inducción, las células
son receptivas al estímulo morfogénico y hay una relación directa con el tipo,
concentración y combinación de reguladores del crecimiento agregados al medio
de cultivo y el órgano a desarrollar. En la fase de realización, la célula
sufre las sucesivas divisiones para formar el órgano determinado. A partir de
la siembra in vitro de diferentes explantes relativamente grandes y en
condiciones de cultivo adecuadas, puede inducirse la formación de nuevos
órganos de manera directa, sin la formación de callo. Si la formación es de
brotes, raíces o flores se denomina organogénesis directa. Si en cambio se induce
la formación de embriones somáticos, este proceso se denominará embriogénesis
directa. Si por el contrario, a partir de la siembra de un explante in vitro se
observa la proliferación de células en forma desordenada y sin ninguna función
predeterminada, se iniciará la producción de callos o suspensiones celulares.
La diferenciación de órganos a partir de callos, denominada morfogénesis
indirecta, estará condicionada a la previa formación de los meristemoides.
(Banner, J. 1936).
VI.MATERIALES
Y MÉTODOS
Figura 1. Desinfección
de la campana de flujo
laminar.
Figura 2. Introducción
de materiales Y medios en el área de trabajo.
Previamente se preparó
cloralex al 2 % en un frasco, donde posteriormente se introdujeron los
explantes dentro con ayuda de las pinzas, permanecieron ahí durante 5 minutos,
se agitaba periódicamente.
Figura 3.
Preparación de cloralex al 2 %.
Figura 4.
Desinfestación de explantes.
Figura 5. Explantes vegetales en cloralex al 2%.
Se colocaron dos frascos
con agua y un frasco con alcohol del
96%, los cuales se utilizaron para el lavado. La pinza que se utilizó
anteriormente para poner los explantes en el frasco del cloralex se mete en el
frasco del alcohol al 96%, se flameo para eliminar algún tipo de hongo o
bacteria, y se dejó enfriar en un frasco vacío, esto se llevó a cabo al término
de ser utilizado un material como pinza o bisturí.
Figura 7.
Desinfección de material.
Figura 8. Frasco portador de materiales desinfectados.
Ya transcurridos los 5
minutos, en un vaso de precipitados se vertió el cloro que <contenían los
explantes y se realizó el lavado con agua estéril, se mantuvieron ahí durante
un minuto, transcurrido ese tiempo se vertió el agua al vaso de precipitados y
se inició con el lavado de 5 minutos, se retiró el agua nuevamente, terminado
esto, se retiraron los frascos que fueron utilizados para mantener limpia el
área de trabajo.
Figura
9. Lavado de explantes con agua estéril.
Después se colocó el
frasco de alcohol, el mechero y los
frascos con pinzas y bisturí, en este orden para evitar accidentes a la
hora de la esterilización.
Se utilizó una caja de
Petri estéril, se empezó a trabajar en una tapa de esta, obtuvimos dos
explantes con ayuda de las pinzas y con el bisturí se cortaron los extremos los
cuales fueron dañados por el cloro, posteriormente se diseccionaron los
explantes para que cada yema o brote quedaran separados, una vez que se terminó,
se esterilizaron las pinzas y se colocaron en un el frasco vacío, se tomaron
otras frías.
Figura 11. Obtención y disección de explantes vegetales.
Se tomó el frasco del
medio de cultivo, se quitó el sello y tapa la cual se puso sobre otra tapa de
un frasco para evitar contaminación, se tomó un explante con las pinzas y se colocó
en el medio con cuidando que este quedara dentro del mismo y la dirección de los
ápices hacia arriba de lo contrario se
obstruiría su crecimiento, este procedimiento fue el mismo para el cultivo de
explantes en el medio de 14 frascos.
Una vez culminada la siembra
se sellaron los frascos y colocaron en el área de crecimiento.
Figura 13. Frasco
sellado y listo para instalarse en el área de crecimiento.
VII.
RESULTADOS Y DISCUSION
Se cultivaron 15 explantes in vitro de Manihot esculenta, de los cuales 5 se
contaminaron por hongos en la superficie inferior del explante, lo cual se
puede atribuir a que el explante se encontraba contaminado por alguna cepa de
hongo o que el cloro ya no era eficiente, pero este factor no perjudico los
brotes foliares en el explante.
Figura. Explantes sembrados invitro
Figura Crecimiento de explantes
En la siguiente figura se puede observar el
grado de colonización por parte del hongo, observándose como las hifas han
alcanzado a distribuirse en toda la superficie del frasco.
Figura. Explantes contaminados
El 33 % de los explantes sembrados in vitro
han sido contaminados por la presencia de un hongo.
Según Bregmann y Moon lograron un mayor número
de brotes en diversas especies de Paulownia al utilizar reguladores de
crecimiento, lograron incrementar el número de brotes cuando los explantes
incluían parte del peciolo.
Por otra parte Kadkade y Seibert encontraron
que se mejoró la eficiencia tanto para el crecimiento en callo como para la
organogénesis al exponer los cultivos a la luz roja durante cinco minutos todos
los días.
VIII.CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES
Conclusiones:
Debido a lo realizado ya antes
mencionado en la presente practica se concluye que si la siembra de material in
vitro se realiza de forma aséptica: esterilizando el material a utilizar,
desinfectándose las manos con alcohol, los resultados son favorables, es decir
el material cultivado no se infecta de hongos o bacterias; también se concluye
que probablemente la planta que se utilizó (manihot
esculenta) estuvo contaminada debido a que el primer día después de la
siembra se presentó un micelio alrededor del explante.
Recomendaciones:
- La forma de colocar los frascos en la campana de flujo laminar debe ser
frasco con alcohol- mechero - frascos con pinzas para un mejor manejo de
material que se utilice.
- Todo el material a utilizar debe esterilizarse y estar cubierto con
papel o aluminio para evitar que este se contamine.
- Se recomienda que solo se encuentren dos personas: uno para que se
encargue de sembrar el material in vitro y el otro para que lo apoye pasándole
el material esto para evitar que se infecten los medios de cultivo.
IX.FUENTES
CONSULTADAS
v Luis Mroginski, Pedro
Sansberro y Eduardo Flaschland. 2010. Establecimiento de cultivos de tejidos
vegetales. En: Biotecnología
y Mejoramiento Vegetal II, Argenbio, INTA. pág. 70-84.
v
Antonio
Ballester, 1999 http://digital.csic.es/bitstream/10261/3975/1/ secivtv.pdf
v
Kite, L. (1983), Plant from Test Tubes: an Introductions to
Micropropagation. Timber Press Oregon U.S.A.
v
Davies R.D. et al, (1980). Proceeding of the Fourth John Innes Symposium
the Plant Genoma and Second.
X.
ANEXOS
Se adquirió un anaquel de cinco laminas para
adecuar el área de incubación cerca de la campana de flujo laminar y a un lado
de la ventana para recibir la poca luz sola que entra.
Figura. Anaquel
Debido a que la luz
solar no es la suficiente para todos los niveles del anaquel se requiere hacer
la compra de una lámpara para que todos los explantes reciban la misma
intensidad de luz.
Figura. Lámpara
